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PCR擴(kuò)增試劑盒適合操作的溫度范圍

瀏覽次數(shù):979發(fā)布日期:2022-04-24
  PCR擴(kuò)增試劑盒可在標(biāo)準(zhǔn)的37℃-42℃的溫度范圍內(nèi)操作。過高的溫度會對反應(yīng)體系產(chǎn)生不利的影響,因?yàn)槊笗饾u地失去全部活性。對于RT試劑盒,我們建議客戶在40℃下運(yùn)行反應(yīng),因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶在稍高溫度下具有更高的活性。
  PCR擴(kuò)增試劑盒是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),通過對擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實(shí)時檢測,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
  以探針法熒光定量PCR為例:PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。開始時,探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上,報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,檢測不到熒光信號;PCR擴(kuò)增時,Taq酶將探針酶切降解,使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。
  傳統(tǒng)的PCR進(jìn)行檢測時,擴(kuò)增反應(yīng)后需要進(jìn)行染色處理及電泳分離,并且只能作定性分析,不能準(zhǔn)確定量,易造成污染出現(xiàn)假陽性,使其應(yīng)用受到限制。實(shí)時定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對模板的定量,且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好、自動化程度高和無污染的特點(diǎn),使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。
  在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的數(shù)個循環(huán)里,熒光信號變化不大,接近一條直線,這樣的直線即是基線,這條線是可以自動生成也可以手動設(shè)置的。之后反應(yīng)會進(jìn)入指數(shù)增長期,這個期間擴(kuò)增曲線具有高度重復(fù)性,在該期間,可設(shè)定一條熒光閾值線,它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,但一般會將熒光閾值的缺省設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值,這個值與起始濃度的對數(shù)成線性關(guān)系,且該值具有重現(xiàn)性。
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